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法醫毒物近代分析方法

儀器分析方法

法醫毒物分析流程

https://www.tpa.moj.gov.tw/media/247259/%E6%AA%A2%E9%A9%97%E6%B5%81%E7%A8%8B%E5%9C%96_1%E6%A8%93%E6%B5%B7%E5%A0%B1.png?width=959&height=719&mode=max

  • 傳統上，多重標的法醫學篩檢方法是以三段四極柱技術為基礎
  • 掃描篩檢的目的是發現那些濃度可能導致中毒或是致死的毒物，氣相層析質譜儀的全圖譜掃描模式一般能滿足這一類的應用要求。
  • 實驗室通常需要檢測樣品中低至100pg的藥物成分。
  • 對於那些更低濃度甚至是微量的藥物分析，需要利用選擇離子監測（SIM）模式以提高分析靈敏度。
  • 全掃描圖譜和氮磷偵測器做為定性分析，選擇離子掃描（SIM）做為定量分析。

一般固相萃取法之操作步驟順序​

column conditioning → sample application →column wash → elution of drugs

生物樣品前處理​

步驟​

  1. 加入蛋白質沉澱溶劑(ACN...)(稀釋10x)
  2. 冰在 -20度C，10分鐘~1小時
  3. 離心，10分鐘、4度C
  4. 取上清液

基質效應​

  • 生物樣品常有許多基質是我們不想看到，但又有強的訊號的，通常部分可以以前處理消除，不能消除或無法有效減弱的會以Blank校正。
  • 上機步驟：
  1. 先打blank觀察在一般血液及同樣的方法中可能出現什麼訊號。
  2. 再打入樣品，觀察其餘的peak。

質譜

質譜分析​

  • 質譜分析是一種將待測物質通過質譜儀後，利用質譜儀所得到的質譜圖譜來進行質譜分析的方法
  • 質譜分析的原理是利用待測物質的分子在質譜儀中被游離後，形成分子離子，再經過電子碰撞，形成碎片離子，最後再通過質譜儀的質量分析器進行質量分析

離子化​

  • 電灑游離法（ESI）屬於一種軟性游離源，可在正電與負電下操作
  • 化學游離法（CI）通常可以得到較完整的分子離子，利於觀察推測待測分析物之分子量
  • 電子游離法（EI）是常見的氣相質譜儀使用的離子源，通常會設定在 70 eV 下操作

TOF/MS​

  • 高精確度、低靈敏度
    • 非常適合用於定性，不太適合定量

LC vs. GC​

  • LC：
    • 適合低揮發性、熱不穩定性
  • GC：
    • 適合高揮發性
    • 可透過衍生化改善化合物不穩定性

GC/MS 方法開發​

  • 重要：不能碰到水(加熱會膨脹，影響訊號，如：peak變寬...etc)

衍生化​

  • 目的：改善物質不穩定性、熱不穩定性、提升分離效率...
  • 步驟：
  1. 讀PAPER看使用什麼衍生化試劑
  2. 配置衍生化試劑(純 ACN 或 MeOH 當 solvent)
  3. 化合物加入衍生化試劑，調整時間與溫度參數(看 paper )
  4. 衍生化後稀釋
  5. 上機

衍生化方法​

  • 部分
  • 常用的化學衍生方法主要有
    • 烷化反應 (alkylation)
    • 醯化反應 (acylation)
    • 矽烷化 (silylation)
    • 雙衍生反應
  • 衍生化試劑
    • AA
    • TFA
    • PFPA
    • HFBA
    • PFOC
    • 4-CB
    • TFA/MTBDTFA
    • PFPA/MTBDTFA
    • HFBA/MTBDTFA

LC 方法開發​

Infusion​

  • 目的：透過二次質譜尋找子離子對(2~4個，一個定性、一個定量)，並用於後續LC/MS建立分析資料庫、方法開發
  • MRM transition
  • ESI-MS/MS
    • ion source: ESI
      • (+) OR (-)
    • mass analyser: Triple Quadruple
  • 步驟：
    • 尋找 standard 的 mass (m/z)
    • 紀錄並抓取peak
      • ESI(+)：STD mass + 1
      • ESI(-)：STD mass - 1
    • 透過質譜得到二~四個 peak 最高的子離子(指定質量二次質譜撞碎得到)，通常只需要 2個 (一個定性、一個定量)，多抓是為了確認與其它文獻中視相同。

LC/MS-MS​

  • 過 column 分離化合物，確認 Retention time ，並以 Infusion 子離子做雙重確認。
  • 步驟：
    1. 裝置合適 column
    2. 選擇位置與方法，放置標準品到進樣盤
    3. 平衡column並觀察壓力
    4. 壓力 < 20 開始打入樣品
    5. 等待圖譜
    6. 判讀結果(TIC(總離子圖譜))，結果不好的話可以修正以下參數
      • column 材質
      • infusion 結果
      • 沖提梯度
      • 滯留時間
      • ...

方法確效​

  • 常要仰賴過往paper，如：column種類、梯度設定...等。

RT Windows​

  • 設定 RT 窗口，如：一個物質 RT 是 9.0min，可以設定下次過 Column 收8.0 ~ 10.0min。

基質​

  • spike進 plasma、whole boold 跟 blank 裡觀察訊號強度

濃度​

  • 加入不同濃度觀察訊號強度，盡可能找到target peak最強，matrix signal最弱的濃度。
    • e.g.：加入10ppb、50ppb、100ppb，
    • 50ppb 訊號跟 100ppb 訊號差不多的話，開始找 10~50ppb 區間訊號最好。
  • 生物樣品稀釋濃度：在蛋白質沉澱的步驟裡，通常加入

安非他命​

  • 質譜分析位置特徵片段是 44 及 91 (ESI/MS daughter ion)

甲基安非他命​

  • 質譜分析位置特徵片段是 58 (比44多一個methyl=12+1*3-1) 及 91

毛髮檢測

http://web.csh.org.tw/web/a32000/?page_id=377

  • 具有時序性
  • 多以原型藥物呈現
  • 檢體保存容易
  • 易受環境物質干擾
    • 前處理過程中，會有清洗的過程，大多都可排除